【Nano Lett.】量子产率接近100%，用于生物传感的纳米域增强型稳定多功能荧光探针

摘要

制备高量子产率、稳定且多功能的荧光探针在生物医学和光电传感领域具有重要意义。本研究设计并制备了一种基于三苯胺的D−π−A型荧光分子（TPA-CN），其荧光量子产率达到88.84%。以聚苯乙烯纳米球为载体，将TPA-CN封装在纳米球内部形成纳米域限制结构。这些纳米域增强型荧光纳米球展现出98.21%的荧光量子产率。利用抗原−抗体特异性和生物酶的选择性催化活性，以氯霉素为模型目标，设计了一种双信号读出生物传感器（荧光和比色模式），用于超灵敏且无需仪器的测定。在荧光模式下，检测限为24 pg/mL，30分钟内完成，比酶联免疫吸附测定法（ELISA）灵敏38倍，速度快10倍。纳米域增强型荧光探针和动态生物传感器为公共卫生和环境监测需求提供了一种强大且多功能的解决方案。

引言

生物传感器因其快速、便捷和灵敏的优势，成为即时检测危险因素的满意工具。将生物识别元素与化学技术相结合，应用纳米材料，构建酶复合物，可以缩短检测时间，显著提高生物传感器的特异性、亲和力和灵敏度。依赖有色指示剂（例如染料或纳米颗粒）的比色生物传感器具有简单和低成本的优势，但其灵敏度不足和稳定性低限制了它们的更广泛应用。依赖荧光指示剂（荧光团）的荧光生物传感器比比色生物传感器具有更高的灵敏度，但现有的荧光探针量子产率低，标记和分离过程复杂，稳定性差，且功能单一。这些光学生物传感器的信号探针问题限制了荧光生物传感器的进一步发展。

随着基于先进纳米材料的生物传感器潜在应用的快速出现，合成具有高量子产率、稳定性和灵敏度的纳米材料变得更加关键。大量工作致力于荧光团的合成、修饰和功能化。通过优化反应条件、调整掺杂模式、纳米晶体的表面钝化和表面活性剂功能化来提高量子产率。然而，这些方法大多操作复杂，且容易引入杂质。

纳米限制域在材料科学中的使用日益增多，其属性和潜力已被广泛认可。当基质的限制空间尺度减小到几纳米甚至更小尺寸时，限制空间内物质的行为趋向于显著变化，从而改变基质的物理属性。通过在笼状腔室内的限制，可以防止或促进聚集，进而增强或猝灭荧光。核心荧光团呈现多种机制，允许可调的发光，如电子/结构弛豫诱导的多荧光、振动控制的褪色和聚集诱导的发光。将荧光团封装在纳米级笼状腔室内，也可以实现物质的反应和光学稳定性。这些考虑为从头设计和构建高量子产率、稳定且多功能的荧光探针提供了充分的灵感。

作者设计并合成了一种新型D−π−A型荧光分子（TPA-CN），将基于三苯胺的荧光染料的量子产率提高到88.84%。他们应用75纳米聚苯乙烯纳米球（PS NSs）作为壳层限制载体，制备了量子产率高达98.21%的纳米域增强型荧光纳米球（基于TPA-CN的纳米球，FNs）。聚苯乙烯壳不仅提供了有效的封装，还提供了卓越的稳定性和功能化潜力。此外，作者将辣根过氧化物酶（HRP）和生物识别分子共价结合到FN表面，创建了具有免疫识别能力的荧光/比色纳米探针（F/C NPs）。他们使用氯霉素作为模型目标评估测定性能。这种双模式多功能生物传感方法实现了无需仪器、超灵敏且快速的检测。两种集成信号输出之间的灵敏度、检测线性范围和信号解码的差异，允许双模式传感技术灵活解决不同的目标监测场景。

方案1. 纳米域增强型双模式动态生物传感器（NDD生物传感器）的示意图：（A）荧光分子的设计和纳米限制增强策略，用于制备荧光纳米球（基于TPA-CN的纳米球，FN）；（B）制备具有荧光、催化和识别能力的多功能探针；（C）NDD生物传感器的两种检测模式

结果与讨论

分子制备与表征

作者首先通过Suzuki偶联使用Pd(PPh₃)₄催化剂，高产量合成了蓝色荧光分子TPA-CN。他们通过核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和液相色谱-质谱（LC-MS）进行了完整的结构表征。TPA-CN固体在日光下呈黄色，在UV302照射下可以激发出明亮的荧光，TPA-CN在四氢呋喃（THF）中溶解时发出蓝色荧光。

图1. 荧光分子（TPA-CN）的合成和荧光特性。（A）一锅法合成TPA-CN（合成产率：91.13%）以及TPA-CN在不同光照条件下（日光和UV302）的粉末和溶液状态。（B）TPA-CN的分子能隙和LUMO及HOMO轨道分析。（C）TPA-CN在溶液中的激发和发射光谱（溶剂：THF）；激发波长为377 nm，发射波长为482 nm。（D）TPA-CN溶液的量子产率（溶剂：THF）。（E）TPA-CN在不同极性常见有机溶剂中的荧光发射光谱。（F）TPA-CN在不同水分数（体积%）溶液中的荧光发射光谱。（G）不同体积分数水溶液中荧光发射强度的变化。（H）不同溶剂中的TPA-CN（第一行：日光；第二行：UV302）。（I）不同体积分数水溶液中的TPA-CN（第一行：日光；第二行：UV302）。

为了阐明TPA-CN的电子跃迁行为，作者通过密度泛函理论进行了理论计算。他们发现LUMO的电子云主要集中在噻吩、C−C双键和氰化物上，而HOMO分布在整个共轭主链上，显示出明显的给体−受体相互作用。荧光光谱显示激发和发射最大值之间有较大的距离，分别为377和482 nm。作者指出，超过100 nm的大斯托克斯位移减少了自吸收对荧光的干扰，提高了光稳定性，并确保分子可用于制备具有高灵敏度和选择性的荧光探针。

作者发现TPA-CN溶液的量子产率为88.84%，显著高于其他常见的基于三苯胺的荧光染料。他们认为这可能是因为引入−CN基团的分子具有更强的电子吸引基团，增强了分子内电荷转移的程度，从而提高了量子产率。TPA-CN溶液从激发态回到基态的平均时间为3.7 ns，足以满足荧光探针的要求。该分子的电子给体−受体系统表现出明显的溶剂变色效应。作者在常见溶剂中探测了TPA-CN的荧光发射，发现TPA-CN的最大发射峰略微红移，随着溶剂极性的增加，荧光强度减弱。

为了研究TPA-CN的聚集荧光特性，作者在H2O/MeOH系统中研究了TPA-CN的荧光发射。他们发现TPA-CN的荧光随着水分数（体积%）的增加而减少，其发光显示出减弱和红移的趋势，这是由于溶剂极性增加而导致的扭曲分子内电荷转移（TICT）效应的典型特征。当体积百分比达到60%时，分子聚集度增加，TICT过程受到限制。分子间堆叠限制了自由旋转并减少了分子间相互作用。因此，激发态能量以辐射的形式发射，荧光增强，荧光发射峰蓝移，显示出聚集诱导发射增强的特性。作者指出，当体积百分比超过85%的阈值时，TPA-CN聚集并沉淀为大团簇，导致荧光爆发和荧光强度降低。TPA-CN的荧光特性，特别是聚集诱导发射特性，为制备高亮度荧光纳米球和高灵敏度检测探针提供了可能性。

微球制备与表征

当限制基质的限制空间尺度减小到纳米尺度甚至更小尺寸时，限制空间内物质的行为趋向于显著变化。作者制备了纳米结构域增强型稳定荧光纳米球，通过将TPA-CN嵌入纳米级PS NSs，限制荧光分子的内部运动。纳米域增强策略实现了98.21%的卓越量子产率和3.4 ns的荧光寿命。他们发现，在一系列温度条件下储存，荧光强度随温度升高而降低。这可能是由于PS NS表面在储存过程中的小孔被打开，一些分子被释放到系统中，聚集状态发生了变化。因此，FN是具有优异光学性能和巨大应用潜力的纳米颗粒。

图2. F/C NPs的制备、表征和荧光特性。（A）通过溶剂化、激活和偶联三步法制备F/C NPs（Sulfo-NHS和EDC为激活剂）。（B）FNs的荧光量子产率。（C）基于三苯胺的荧光分子（化合物1、2、3和4）和普通荧光小分子（化合物5和6）制备的荧光纳米球的荧光量子产率比较。（D）不同荧光分子作为限制分子嵌入PS NSs的荧光量子产率。数字1–7是嵌入分子的序列号。（E）TPA-CN和FNs在不同pH下荧光强度的变化。（F）FNs和F/C NPs荧光光谱的比较。（G）溶解−嵌入过程中的荧光变化。（H）F/C NPs的扫描电子显微镜（SEM）图像（比例尺为100 nm）。（I）PS NSs、FNs和F/C NPs的水合动力学直径比较。（J）PS NSs、FNs和F/C NPs的zeta电位。

作者选择了四种基于三苯胺的荧光分子和两种普通荧光分子嵌入纳米球中，并测定了它们的荧光量子产率。他们发现基于TPA-CN的纳米球的荧光量子产率远高于含有普通荧光小分子或其他类似化合物的纳米球。将噻吩基团连接到三苯胺上显著提高了量子产率，而在噻吩桥的另一端添加氰化物将量子产率提高到基于1的纳米球的818倍和基于2的纳米球的1.5倍。然而，从噻吩桥的另一端连接醛基团以获得基于3的纳米球或从“三叶草型”分子获得基于4的纳米球并没有提高量子产率。这些结果表明，利用分子内电荷转移特性和纳米限制是提高基于三苯胺的荧光微球量子产率的有效策略。

作者发现FNs的荧光量子产率高于荧光量子点（QDs）和碳点（CDs）等常见纳米材料。与TPA-CN相比，FNs受酸度和碱度的影响较小，在不同pH环境中保持强荧光性能，这种多功能性满足了多种基质、检测介质和目标的需求。FNs的荧光强度在常见缓冲盐溶液中变化在15%以内，在不同质量分数的NaCl溶液中变化在5%以内。这表明FNs在抵抗渗透压和盐离子方面具有显著优势。

检测微球的制备与表征

PS NSs的易修饰性和单分散性促进了多功能探针的制备，通过激活PS NS羧基并偶联抗体（Abs）和HRP，获得具有荧光和颜色双重信号的纳米球。Abs的偶联还允许对目标分子进行特异性识别。作者在偶联前后检查了荧光光谱，发现FNs和F/C NPs的激发和发射波长与TPA-CN相似。在TPA-CN嵌入PS NSs的过程中，他们测试了它们的荧光光谱。分子存在状态与荧光强度之间存在直接关系。在相同浓度的TPA-CN下，限制在PS NS中的分子越多，荧光强度越强。嵌入后的荧光强度大约是嵌入开始时荧光强度的3倍。这表明TPA-CN成功嵌入纳米球中，实现了荧光增强，并证实嵌入和偶联过程对激发和发射波长几乎没有影响。

作者通过扫描电子显微镜（SEM）图像提供了视觉证据，表明PS NSs的形态不受膨胀或修饰过程的影响，保持均匀的球形形态。PS NSs、FNs和F/C NPs的水合直径在膨胀前后没有显著变化，在HRP和Ab识别位点偶联后增加。他们测试了PS NSs、FNs和F/C NPs的zeta电位。PS NSs和FNs的负电位可以归因于羧酸化表面。在HRP和Abs偶联后，zeta电位从−22.70变为−31.17 mV，表明F/C NPs表面负电位显著增加。抗体和HRP的成功偶联为传感器特异性识别目标分子以及功能扩展提供了基础。

氯霉素检测

长期摄入含有过量氯霉素残留的食物可能导致消化系统疾病。过量摄入氯霉素可能对人的肝脏和骨髓造血功能造成损害，导致再生障碍性贫血和血小板减少等健康危害。氯霉素被国际食品科学界列为禁用物质。

作者以氯霉素为模型目标，评估了纳米域增强型双信号读出生物传感器。该方法利用竞争性结合进行定量检测。他们通过将完整的抗原（CAP-BSA）装载到磁性纳米粒子（MNP）上，形成MNP@CAP-BSA（cMNP），特异性捕获氯霉素，然后与相应的抗体（装载在F/C NPs上）特异性结合。在与氯霉素的竞争免疫反应后，免疫复合物的荧光强度或催化显色活性的变化作为定量分析的有效信号。

图3. 基于F/C NPs的NDD生物传感器对氯霉素检测的原理证明。（A）通过竞争免疫吸附测定法检测氯霉素的实验程序，包括三个步骤：特异性识别、磁分离和双信号读出。CAP-mAb表示氯霉素抗体。（B）MNPs和cMNPs的水合动力学粒度比较。（C）MNPs和cMNPs的zeta电位变化。（D）不同浓度的cMNPs与氯霉素-mAb结合后，与酶标二抗反应的催化TMB色谱图，以吸光度变化值表示。（E）cMNPs和cMNP@F/C NPs的荧光光谱。（F）cMNP的SEM图像（比例尺为200 nm）。（G）cMNP@F/C NP的SEM图像（比例尺为200 nm）。

作者制备了cMNPs，并通过将CAP-BSA偶联到1000 nm超顺磁性MNPs表面作为目标隔离载体来表征。他们验证了测定原理的可行性，并进一步验证了cMNPs的成功制备，以及验证了偶联CAP-BSA的活性。

为了探索F/C NPs的应用潜力，作者测试了信号−浓度关系，并发现在一定范围内，FNs和F/C NPs的荧光信号均与浓度呈良好的线性关系。当F/C NPs和cMNPs的性质同时满足预期时，将两者以低浓度混合并在37°C下反应30分钟。洗涤后的cMNP@F/C NPs进行荧光测试，发现激发和发射光谱与F/C NPs一致。SEM显示，cMNPs能够通过免疫反应成功与较小粒径的F/C NPs形成复合物，并且一个cMNP能够结合多个F/C NPs。这为纳米域增强型双模式动态生物传感器（NDD生物传感器）能够检测目标提供了有力证据。

作者构建的NDD生物传感器呈现荧光和比色信号输出。检测探针的高荧光强度使目标检测敏感，不同浓度的检测探针产生不同的荧光激发强度。检测探针的催化显色能力与智能手机摄像头的RGB识别相结合，实现了无需仪器的目标检测。他们验证了智能手机对RGB的识别与仪器分析的输出值一致。NDD生物传感器的多功能性提供了更广泛的适用性和更便捷的检测。

图4. NDD生物传感器对氯霉素检测的检测性能。（A）NDD生物传感器的双信号读出模式。荧光信号由多功能酶标记物读出；比色信号由智能手机拍摄，识别R值输出。（B）NDD生物传感器（模式F和模式C）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测氯霉素的标准曲线。（C）NDD生物传感器（模式F和模式C）和ELISA检测氯霉素的线性范围。（D）氯霉素及其他抗生素的分子结构。（E, F）在模式F和模式C中检测氯霉素的特异性评估（P < 0.0001）。

为了优化灵敏度，作者研究了NDD生物传感器检测氯霉素的关键参数。在F/C NP制备阶段，他们优化了偶联HRP的浓度以获得更优越的探针性能和显色检测。他们也优化了F/C NP和cMNP的浓度以及免疫反应的竞争反应时间。综合考虑荧光和比色检测性能，当F/C NP和cMNP浓度均为40 μg/mL且竞争反应时间为25分钟时，实现了最佳的检测效果。

使用优化的实验条件评估了NDD生物传感器检测氯霉素的灵敏度（检测限，LOD）和线性范围。在模式F中，随着氯霉素浓度从10 pg/mL增加到100 ng/mL，荧光强度成正比增加。模式F和模式C的线性范围分别为30 pg/mL至30 ng/mL和1 ng/mL至1 μg/mL。基于线性回归分析，NDD生物传感器的LOD计算为模式F 24 pg/mL和模式C 841 pg/mL。模式F的高灵敏度是由于纳米域增强型荧光量子产率探针，更适合于复杂样本中低浓度氯霉素的检测。模式F比ELISA灵敏38倍，节省了90%的分析时间。模式C的灵敏度略高于ELISA。

特异性是评估生物传感器性能的另一个关键参数。作者研究了最常见的干扰氯霉素检测的抗生素，以验证NDD生物传感器的特异性。NDD生物传感器对氯霉素表现出高度选择性，并具有出色的抗干扰能力，这归因于目标抗原与抗体功能化信号探针和免疫载体的特异性结合。

与HPLC-MS相比，NDD生物传感器不需要专门的大型仪器和高度训练的人员，节省了测试成本。NDD生物传感器比ELISA节省了更多的测试时间，同时保持更高的灵敏度。与之前的氯霉素快速检测方法相比，该方法的灵敏度高达0.024 ng/mL，具有动态线性范围。

图5. NDD生物传感器与其他检测方法的比较以及NDD生物传感器在实际样本中的测试性能评估。（A）NDD生物传感器与HPLC-MS和ELISA的性能特点比较。（B, C, D）基于NDD生物传感器（模式F和模式C）的氯霉素添加回收测试。（E）基于NDD生物传感器（模式F和模式C）的实际样本中氯霉素的检测。

作者在实际样本中测试了NDD生物传感器对氯霉素的检测。在模式F中，添加回收率在84.53–120.05%之间，变异系数在4.14–7.96%之间。在模式C中，添加样本的回收率在80.61–115.72%之间，变异系数在2.78–7.58%之间。作为对NDD生物传感器在实际样本中性能的进一步验证，通过HPLC-MS和ELISA检测氯霉素的结果一致，确定样本10、23、30和40为氯霉素阳性。结果表明，NDD生物传感器的两种模式在食品中检测氯霉素具有高准确性。

因此，这种高选择性的NDD生物传感器适合作为复杂食品基质分析和其他生物分析领域的平台。NDD生物传感器是一种新型的用户友好且节省成本的生物传感平台，具有出色的性能。

结论

总之，作者合成了一种新型D−π−A型荧光分子（TPA-CN），量子产率高达88.84%，纳米域增强型荧光纳米球具有卓越的量子产率（98.21%）。基于这些荧光纳米球，LODMode-F为24 pg/mL，比ELISA灵敏38倍，速度快10倍。在模式C中，生物传感器可以实现无需仪器的筛查，灵敏度没有显著降低。本工作中报道的NDD生物传感器结合了制造简单、快速响应和低成本的优势，适用于非色谱应用，为实时、半自动化风险因素监测提供了实用的策略。然而，这项工作没有实现多重检测和便携式微流控芯片的开发。未来的工作将专注于通过探索纳米球内限制域的限制机制和分子构型，开发具有更好荧光特性的信号探针，以构建能够快速检测多个目标并在宽线性范围内检测的生物传感器。

参考文献

Zhang, Y.; Feng, N.; Hu, X.; Wang, X.; Tao, J.; Ji, Z.; Yang, Y.; Ma, J.; Chen, Y. Nanodomain-Enhanced Stable and Multifunctional Probes with Near 100% Quantum Yield for Versatile Biosensing. Nano Lett. 2024, acs.nanolett.4c04376. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c04376.